離子交換層析分離純化生物大分子的過(guò)程，主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進(jìn)行選擇分離的?，F(xiàn)已成為分離純化生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)中使用最頻繁的純化技術(shù)之一。
1. 離子交換劑的選擇
在進(jìn)行分離純化時(shí)，要求層析柱具有高負(fù)載量、易于操作及使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，其中分離介質(zhì)是最主要的影響因素，因此，分離介質(zhì)的選擇尤為重要。
1.1 品種的選擇：
應(yīng)根據(jù)被分離純化目標(biāo)產(chǎn)物所帶電荷的種類(lèi)、分子的大小、物理化學(xué)性質(zhì)及所處的微環(huán)境等因素，選擇適宜的離子交換層析介質(zhì)。對(duì)于無(wú)機(jī)小分子而言，分離介質(zhì)的選擇相對(duì)容易，但對(duì)于生物大分子就必須考慮更多的因素。
蛋白質(zhì)等生物大分子是由多種氨基酸所組成的，在不同的pH條件下顯示不同的電性，而生物大分子對(duì)最適宜的pH環(huán)境具有特定的要求，因此，必須首先了解目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)及適宜的微環(huán)境，根據(jù)這些條件選擇合適的離子交換劑種類(lèi)。
是選擇陽(yáng)離子交換劑還是選擇陰離子交換劑，主要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH 下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點(diǎn)為4，穩(wěn)定的pH 范圍為6~9，由于這時(shí)蛋白帶負(fù)電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進(jìn)行分離。
1.2 骨架的選擇：
應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量、要求達(dá)到的純度及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等因素，選擇合適骨架（基質(zhì)）的離子交換劑。
通用型的聚苯乙烯離子交換樹(shù)脂具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、全交換容量高等特點(diǎn)，適用于如抗生素、有機(jī)酸、動(dòng)物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對(duì)于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產(chǎn)品，仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的生化分離專(zhuān)用介質(zhì)。
纖維素離子交換劑價(jià)格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價(jià)格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH 變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機(jī)械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價(jià)格較貴。
理想的分離介質(zhì)應(yīng)該不但易于吸附，還要易于洗脫，如果目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)于離子強(qiáng)度和pH值的變化不敏感，可以考慮采用高電荷密度的強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)。如果對(duì)這些因素比較敏感，則應(yīng)采用弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)。如果大分子物質(zhì)被吸附后，結(jié)合比較牢固，往往難以洗脫，采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性，則應(yīng)選用功能基團(tuán)密度低的介質(zhì)。
強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)，適用的pH 范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH 下的分離，但由于電性較強(qiáng)，有時(shí)易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)，其選擇性有較大的范圍，且不易使蛋白質(zhì)失活，故一般適用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，但其適用的pH范圍較窄。
1.3 粒徑的選擇：
分離介質(zhì)粒徑的大小對(duì)離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來(lái)說(shuō)分離介質(zhì)的粒徑小，分辨率高，但平衡離子的平衡時(shí)間長(zhǎng)，流速慢；粒徑大則柱的流速較快，壓降小，但分辨率低，負(fù)載量也較小。所以大顆粒的分離介質(zhì)適合于對(duì)分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的分離介質(zhì)適合于需要高分辨率的精細(xì)分離或產(chǎn)品的精制階段。
2. 操作中注意事項(xiàng)
2.1 預(yù)處理：
在離子交換劑的工業(yè)產(chǎn)品中，常含有少量的有機(jī)低聚物及一些無(wú)機(jī)雜質(zhì)，在使用初期會(huì)逐漸溶解釋放，影響目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，工業(yè)級(jí)離子交換劑在使用前必須進(jìn)行預(yù)處理。
通用型的離子交換樹(shù)脂通常使用酸、堿進(jìn)行處理，可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液，以4~6倍樹(shù)脂床體積交替進(jìn)行處理，在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對(duì)于大孔型的樹(shù)脂，還需要用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行處理，以除去生產(chǎn)過(guò)程中所用的有機(jī)物殘余物。對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，不但能提高其工作容量，更可提高被分離產(chǎn)品的純度。經(jīng)預(yù)處理后的樹(shù)脂，最后應(yīng)轉(zhuǎn)為分離過(guò)程中適用的離子型態(tài)。
對(duì)于生化專(zhuān)用的離子交換劑，以多糖類(lèi)骨架為主的介質(zhì)，一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質(zhì)在分離過(guò)程中盡量減少pH值的變化，需要用大量的去離子水進(jìn)行清洗，然后用緩沖液進(jìn)行平衡。
分離介質(zhì)的預(yù)處理可以在柱內(nèi)進(jìn)行，也可以在燒杯等容器中進(jìn)行。在柱內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，或溶液體系改變及操作溫度變化時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)氣泡，尤其在使用內(nèi)徑較小的柱時(shí)。氣泡一經(jīng)出現(xiàn)，必須及時(shí)清除，否則對(duì)層析工藝有明顯的影響。
2.2 緩沖液平衡介質(zhì)：
pH值是離子交換層析的操作中的一個(gè)重要因素，而pH的穩(wěn)定及改變通常是用緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。
在選擇緩沖液時(shí)，pH和離子強(qiáng)度是兩個(gè)關(guān)鍵性的因素，它不僅影響到分離介質(zhì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果，而且還影響到產(chǎn)品的收率。選用的pH值取決于目標(biāo)產(chǎn)物的等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和溶解度，不但要使被分離的物質(zhì)成為可以進(jìn)行交換的離子，還要維持其較高的活性。同時(shí)也應(yīng)該考慮到離子交換劑的pK值。
由于緩沖液本身帶電，所以也會(huì)與離子交換層析介質(zhì)結(jié)合。這種結(jié)合將帶來(lái)兩方面的干擾，一方面降低緩沖液的濃度，進(jìn)而降低了緩沖能力；另一方面是與分離介質(zhì)進(jìn)行交換，從而與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)介質(zhì)的交換容量。因此，在使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，要避免采用磷酸鹽之類(lèi)的帶負(fù)電的緩沖液，在使用陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則要避免采用Tris之類(lèi)的帶正電的緩沖液。由于分離介質(zhì)的種類(lèi)不同，起始過(guò)程也略有不同，在通常情況下，使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，起始緩沖液要高于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值；使用陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則起始緩沖液要低于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值。
2.3 層析柱的操作：
2.3.1 操作方式：
由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動(dòng)相，可在流經(jīng)柱時(shí)進(jìn)行分離，因此，離子交換可以采用柱式操作，以層析形式進(jìn)行分離。在分離過(guò)程中，未被吸附的物質(zhì)不斷流出反應(yīng)體系，使平衡不斷右移，是一種動(dòng)態(tài)平衡，所以也稱為動(dòng)態(tài)操作。動(dòng)態(tài)操作方式分離效果好，適用于各類(lèi)樣品，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。在層析分離的操作中，層析柱的裝填情況對(duì)分離有一定的影響，介質(zhì)在柱內(nèi)要分布均勻，尤其不允許氣泡的存在，也應(yīng)防止介質(zhì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象。
對(duì)于一些粘度較大的樣品，進(jìn)行初步提取分離時(shí)，也可以采用“靜態(tài)”處理方法，經(jīng)離子交換劑與需處理的工作液在反應(yīng)容器中進(jìn)行攪拌，當(dāng)達(dá)到吸附平衡后，將介質(zhì)與殘液分離，裝入柱中進(jìn)行洗脫。這種靜態(tài)分批操作的方法，工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，如肝素鈉等一些天然產(chǎn)物的初步分離，往往采用這種靜態(tài)分離方式。在靜態(tài)分離方式的操作中，應(yīng)適當(dāng)控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度，若攪拌速度過(guò)快，剪切力過(guò)大，會(huì)造成離子交換顆粒的破碎，難以進(jìn)行過(guò)濾分離；但若攪拌速度過(guò)慢，則影響介質(zhì)與工作液的接觸，也影響交換速率。
2.3.2 柱式操作的種類(lèi)：
固定床分離：在柱式操作中，料液作為流動(dòng)相，在柱內(nèi)自上而下地流動(dòng)，在流動(dòng)的過(guò)程中進(jìn)行吸附。為了得到較好的分離效果，對(duì)分離柱有三點(diǎn)最基本的要求：分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板，以防止流動(dòng)相產(chǎn)生偏流；分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小，以防止分離過(guò)程中色譜帶混合或擴(kuò)展；無(wú)論大小，分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中，可以進(jìn)行正向洗脫，也可以進(jìn)行逆向洗脫，一般情況下，逆向洗脫或再生可獲得較好的效果，但對(duì)操作有較為嚴(yán)格的要求。
流態(tài)床：流動(dòng)的料液從柱的下端流入，從上端流出，分離介質(zhì)在柱內(nèi)呈流態(tài)狀。此種分離方法對(duì)操作有嚴(yán)格的要求，一般較少應(yīng)用，洗脫方式以采用正向洗脫為好。
2.3.3 工作液對(duì)分離效果的影響：
為了使生化分離達(dá)到高分辨率及高負(fù)載量，工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果，還影響到分離介質(zhì)的使用壽命。生化分離往往是一個(gè)比較復(fù)雜的體系，其中有多種雜質(zhì)存在，不但有簡(jiǎn)單的小分子，還有一些膠體物質(zhì)、脂類(lèi)物質(zhì)等，尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質(zhì)的功能基團(tuán)，或堵塞了介質(zhì)的孔道，造成不可逆污染，縮短分離介質(zhì)的使用壽命。因此，在分離操作前，應(yīng)盡量將工作液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以確保分離的效果。
在生化分離純化過(guò)程中，由于淋洗過(guò)程帶走了一些目標(biāo)產(chǎn)物，或因洗脫不完全而使目標(biāo)產(chǎn)物滯留在介質(zhì)上，造成產(chǎn)物的損失，是影響產(chǎn)品收率的重要因素，同時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化引起失活，也將影響活化收率。在離子交換過(guò)程中加入一些穩(wěn)定劑或保護(hù)劑，不但可以提高收率，還可提高分離介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性。
2.3.4 流速對(duì)分離效果的影響：
離子交換層析分離中，流速是影響分離效果的一個(gè)重要因素。為了獲取優(yōu)良的分離效果，應(yīng)根據(jù)離子交換劑的種類(lèi)、粒徑、工作液中有效成分的分子結(jié)構(gòu)等因素，進(jìn)行試驗(yàn)，以確立較佳的試驗(yàn)參數(shù)。若目標(biāo)產(chǎn)物的分子量相對(duì)比較小，且介質(zhì)的孔徑比較大時(shí)，因?yàn)橛欣趥髻|(zhì)作用，可采用較高的流速。而對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物為生物大分子，且介質(zhì)的孔徑相對(duì)于被分離物質(zhì)分子較小時(shí)，由于分子的擴(kuò)散速率較慢，則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時(shí)，因傳質(zhì)速率較低，也應(yīng)采用較低的流速。
流速不但影響交換吸附的效果，也影響洗脫的效果，通常情況下，洗脫時(shí)的流速要比交換吸附時(shí)慢些。
2.4 介質(zhì)的洗脫、再生方式：
當(dāng)離子交換劑失效后，應(yīng)進(jìn)行洗脫，其基本原理是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子或基團(tuán)，把交換吸附到介質(zhì)顆粒外表面和內(nèi)部的目標(biāo)產(chǎn)物解吸下來(lái)。吸著物不同，其活潑性不同，因此，應(yīng)選擇合適的洗脫劑，將蛋白質(zhì)從介質(zhì)上洗脫下來(lái)，收集分離純化的產(chǎn)物。
離子交換層析大致有三種洗脫方式：
一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質(zhì)，可采用稀的酸、堿或鹽類(lèi)溶液，也可選用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，其中以鹽溶液為主，依據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)及最終得到產(chǎn)物的劑型進(jìn)行選擇。由于被吸著的物質(zhì)往往不是單一的品種，各種物質(zhì)所帶的電荷電量不同，與介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度不同，即使使用同一種洗脫劑，容易被替換的物質(zhì)先脫離介質(zhì)流出，結(jié)合力較強(qiáng)的物質(zhì)后流出，只要通過(guò)分級(jí)收集，就可以把各種物質(zhì)分離，得到較純凈的產(chǎn)物。這種方法多用于對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的性能了解很清楚時(shí)的分離，或用于分析類(lèi)的分離。
第二種為分步洗脫，即分別用不同濃度的鹽溶液進(jìn)行洗脫。分離介質(zhì)在交換吸附過(guò)程中，會(huì)有多種蛋白質(zhì)被吸附，如果采用一個(gè)恒定的洗脫條件，有時(shí)不能將所有的組分適當(dāng)?shù)胤珠_(kāi)，需要改變洗脫條件?？梢允请A段式的改變，即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進(jìn)行洗脫，可以根據(jù)洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標(biāo)蛋白，不同的鹽濃度可以得到不同的目標(biāo)蛋白。這種分步洗脫的方式，適用于已知性質(zhì)蛋白的分離，尤其適用于規(guī)模生產(chǎn)中，操作方便，易于控制。
第三種為連續(xù)的梯度洗脫，即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH值（一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式），在洗脫劑漸變的過(guò)程中，將不同的蛋白質(zhì)逐一置換，可得到各種不同的蛋白組分，同時(shí)，蛋白質(zhì)一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式，也是洗脫能力相對(duì)最強(qiáng)的洗脫方式，適合于對(duì)電荷性質(zhì)相近組分的洗脫。
在洗脫過(guò)程中，順流洗脫或逆流洗脫均可采用，順流洗脫也稱為正向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相同，逆流洗脫也稱為反向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相反。若料液是自上而下正向通過(guò)交換柱進(jìn)行交換吸附的，則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高，洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達(dá)到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復(fù)雜得多，故目前多以正向洗脫為主。
洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離的效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來(lái)說(shuō)，慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好，但洗脫速度過(guò)慢，會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)，樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中于某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來(lái)提高分辨率。如果分辨率較好，但洗脫峰過(guò)寬，則應(yīng)適當(dāng)提高洗脫速度。
2.5 介質(zhì)的消毒：
在某些純度要求較高的生化產(chǎn)品制備過(guò)程中，往往要求對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行消毒處理，以防止微生物等雜質(zhì)混入目標(biāo)產(chǎn)品中。
采用高溫消毒是最常用的方法，目前大多數(shù)離子交換劑具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性能，均可進(jìn)行高溫消毒處理。但在使用多糖類(lèi)介質(zhì)時(shí)，必須注意，介質(zhì)一定要處于鹽型，而且要在中性條件下才能進(jìn)行高溫消毒處理，否則將會(huì)導(dǎo)致多糖大分子骨架的降解，嚴(yán)重影響介質(zhì)的使用壽命。
NaOH也是一種很好的消毒劑，但要根據(jù)介質(zhì)的耐堿程度和微生物污染的種類(lèi)、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內(nèi)浸泡法，即將一定濃度的NaOH通入柱中，關(guān)閉出液閥，浸泡幾個(gè)小時(shí)后，可達(dá)到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用，可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。
2.6 介質(zhì)的“復(fù)蘇”：
在生化分離過(guò)程中，由于分離體系較為復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)，因此在使用過(guò)程中常出現(xiàn)樹(shù)脂的“中毒”現(xiàn)象。中毒原因可能是由于大分子的多點(diǎn)帶電，與介質(zhì)進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合，致使難以洗脫，使介質(zhì)的有效功能基團(tuán)減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內(nèi)，難以擴(kuò)散出來(lái)，堵塞了孔道，在以后的交換過(guò)程中影響到顆粒內(nèi)功能基團(tuán)的有效工作。除生物大分子外，色素及腐殖酸等都可使介質(zhì)中毒。有時(shí)工作液中的膠狀物質(zhì)被粘附于介質(zhì)顆粒的內(nèi)外表面，覆蓋了功能基團(tuán)，這也是影響介質(zhì)工作容量的重要因素。
由于上述原因，離子交換層析介質(zhì)在使用一段時(shí)間后，可能出現(xiàn)顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質(zhì)收率降低、反壓升高等現(xiàn)象。此時(shí)，需要對(duì)介質(zhì)進(jìn)行凈化處理。對(duì)于介質(zhì)用量比較大，自動(dòng)化程度比較高的規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)采用在原交換柱內(nèi)進(jìn)行，即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過(guò)適量的清水，目的是去除交換柱中的懸浮物，并將床體疏松，還可以將結(jié)塊的介質(zhì)分散，有利于以后介質(zhì)與清洗液的接觸。對(duì)于一般的污染，采用逆流清洗，可減少污染物對(duì)下層介質(zhì)的污染。應(yīng)根據(jù)介質(zhì)種類(lèi)及污染程度的不同，分別選用不同種類(lèi)的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質(zhì)是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡，各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經(jīng)過(guò)上述處理后仍無(wú)明顯改善，尤其是流速無(wú)明顯提高，則要檢查交換柱布水器的紗網(wǎng)是否出現(xiàn)堵塞。
上述過(guò)程即為通常所說(shuō)的“復(fù)蘇”過(guò)程。不同的介質(zhì)應(yīng)選用不同的復(fù)蘇方法，主要取決于介質(zhì)的物理化學(xué)性能及污染物質(zhì)的性質(zhì)。對(duì)于多糖類(lèi)的離子交換劑，每當(dāng)使用一段時(shí)間后，可采用離子濃度較大的緩沖液通過(guò)交換柱或浸泡介質(zhì)，因?yàn)榫彌_液的離子強(qiáng)度較大時(shí)，有利于蛋白質(zhì)大分子脫離介質(zhì)，達(dá)到復(fù)蘇的效果。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介質(zhì)，也可使用NaCl溶液通過(guò)交換柱或浸泡介質(zhì)。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的介質(zhì)，可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進(jìn)行洗脫或浸泡，在高溫下可使吸附在介質(zhì)上的蛋白變性或加快擴(kuò)散速度，也有利于膠體物質(zhì)的破壞，從而使污染物脫離介質(zhì)。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl，更有利于介質(zhì)的復(fù)蘇。
清除沉淀蛋白、脂類(lèi)、疏水性的蛋白及脂蛋白，處理步驟更為復(fù)雜?？刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽(yáng)離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過(guò)這些清洗劑后，都要用至少2倍體積的蒸餾水進(jìn)行清洗。使用有機(jī)溶劑后，交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進(jìn)行清洗，即可以在5倍床體積內(nèi)，使溶劑的含量從0增至100%，然后在下一個(gè)5倍床體積中，使溶劑的含量從100%降到0。
如果經(jīng)過(guò)上述處理，交換柱的工作情況仍沒(méi)有恢復(fù)，可以使用蛋白水解酶，將仍滯留在介質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使其脫離介質(zhì)。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中，在室溫下浸泡過(guò)夜，或在37℃下浸泡一小時(shí)。根據(jù)污染物的情況，也可以采用DNA酶等其它的酶類(lèi)。無(wú)論使用哪一種酶處理后，都要重復(fù)上述清除污染物的清洗步驟，把酶清洗干凈。
脂蛋白對(duì)分離介質(zhì)的污染比較嚴(yán)重，因?yàn)橹鞍准捌渌?lèi)物質(zhì)，很容易粘附在層析柱內(nèi)，最好在進(jìn)行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑，可去除高含量的脂蛋白。
2.7 介質(zhì)的貯存：
各種分離介質(zhì)在使用后都要進(jìn)行清洗后再貯存，這對(duì)于多糖類(lèi)分離介質(zhì)尤為重要。分離介質(zhì)在使用后，先用2個(gè)床體積的清水清洗，然后用2個(gè)床體積的20%的乙醇過(guò)柱。對(duì)于SP強(qiáng)酸性陽(yáng)離子介質(zhì)，要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗，再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經(jīng)過(guò)處理后，可在室溫下貯存，或在4~8℃下長(zhǎng)期存放。貯存過(guò)程中必須將層析柱全部封閉，以防止水分的揮發(fā)，造成干柱。暫時(shí)不用的介質(zhì)必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質(zhì)，都要在4℃~30℃的條件下貯存，并防止冷凍。
離子交換層析分離純化生物大分子的過(guò)程，主要是利用各種分子的可離解性、離子的凈電荷、表面電荷分布的電性差異而進(jìn)行選擇分離的?，F(xiàn)已成為分離純化生化制品、蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)中使用最頻繁的純化技術(shù)之一。
1. 離子交換劑的選擇
在進(jìn)行分離純化時(shí)，要求層析柱具有高負(fù)載量、易于操作及使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，其中分離介質(zhì)是最主要的影響因素，因此，分離介質(zhì)的選擇尤為重要。
1.1 品種的選擇：
應(yīng)根據(jù)被分離純化目標(biāo)產(chǎn)物所帶電荷的種類(lèi)、分子的大小、物理化學(xué)性質(zhì)及所處的微環(huán)境等因素，選擇適宜的離子交換層析介質(zhì)。對(duì)于無(wú)機(jī)小分子而言，分離介質(zhì)的選擇相對(duì)容易，但對(duì)于生物大分子就必須考慮更多的因素。
蛋白質(zhì)等生物大分子是由多種氨基酸所組成的，在不同的pH條件下顯示不同的電性，而生物大分子對(duì)最適宜的pH環(huán)境具有特定的要求，因此，必須首先了解目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)及適宜的微環(huán)境，根據(jù)這些條件選擇合適的離子交換劑種類(lèi)。
是選擇陽(yáng)離子交換劑還是選擇陰離子交換劑，主要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH 下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽(yáng)離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點(diǎn)為4，穩(wěn)定的pH 范圍為6~9，由于這時(shí)蛋白帶負(fù)電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進(jìn)行分離。
1.2 骨架的選擇：
應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量、要求達(dá)到的純度及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等因素，選擇合適骨架（基質(zhì)）的離子交換劑。
通用型的聚苯乙烯離子交換樹(shù)脂具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、全交換容量高等特點(diǎn)，適用于如抗生素、有機(jī)酸、動(dòng)物資源或植物資源的有效成分等一般生化制品的提取分離工藝。而對(duì)于要求分辨率高、制品純度高的一些高附加值的基因工程產(chǎn)品，仍需使用纖維素、葡聚糖、瓊脂糖為基質(zhì)的生化分離專(zhuān)用介質(zhì)。
纖維素離子交換劑價(jià)格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價(jià)格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH 變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機(jī)械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價(jià)格較貴。
理想的分離介質(zhì)應(yīng)該不但易于吸附，還要易于洗脫，如果目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)于離子強(qiáng)度和pH值的變化不敏感，可以考慮采用高電荷密度的強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)。如果對(duì)這些因素比較敏感，則應(yīng)采用弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)。如果大分子物質(zhì)被吸附后，結(jié)合比較牢固，往往難以洗脫，采用苛刻的條件又容易引起大分子的變性，則應(yīng)選用功能基團(tuán)密度低的介質(zhì)。
強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性的強(qiáng)型介質(zhì)，適用的pH 范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH 下的分離，但由于電性較強(qiáng)，有時(shí)易使一些敏感的生物分子變性或失活。弱酸性或弱堿性的弱型介質(zhì)，其選擇性有較大的范圍，且不易使蛋白質(zhì)失活，故一般適用于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，但其適用的pH范圍較窄。
1.3 粒徑的選擇：
分離介質(zhì)粒徑的大小對(duì)離子交換層析柱的分辨率和流速有明顯的影響。一般來(lái)說(shuō)分離介質(zhì)的粒徑小，分辨率高，但平衡離子的平衡時(shí)間長(zhǎng)，流速慢；粒徑大則柱的流速較快，壓降小，但分辨率低，負(fù)載量也較小。所以大顆粒的分離介質(zhì)適合于對(duì)分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的分離介質(zhì)適合于需要高分辨率的精細(xì)分離或產(chǎn)品的精制階段。
2. 操作中注意事項(xiàng)
2.1 預(yù)處理：
在離子交換劑的工業(yè)產(chǎn)品中，常含有少量的有機(jī)低聚物及一些無(wú)機(jī)雜質(zhì)，在使用初期會(huì)逐漸溶解釋放，影響目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，工業(yè)級(jí)離子交換劑在使用前必須進(jìn)行預(yù)處理。
通用型的離子交換樹(shù)脂通常使用酸、堿進(jìn)行處理，可采用1~2 mol/L的鹽酸及氫氧化鈉溶液，以4~6倍樹(shù)脂床體積交替進(jìn)行處理，在酸及堿處理之間須用去離子水洗至中性。對(duì)于大孔型的樹(shù)脂，還需要用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行處理，以除去生產(chǎn)過(guò)程中所用的有機(jī)物殘余物。對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，不但能提高其工作容量，更可提高被分離產(chǎn)品的純度。經(jīng)預(yù)處理后的樹(shù)脂，最后應(yīng)轉(zhuǎn)為分離過(guò)程中適用的離子型態(tài)。
對(duì)于生化專(zhuān)用的離子交換劑，以多糖類(lèi)骨架為主的介質(zhì)，一般貯存在20%的乙醇中。為了分離介質(zhì)在分離過(guò)程中盡量減少pH值的變化，需要用大量的去離子水進(jìn)行清洗，然后用緩沖液進(jìn)行平衡。
分離介質(zhì)的預(yù)處理可以在柱內(nèi)進(jìn)行，也可以在燒杯等容器中進(jìn)行。在柱內(nèi)進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，或溶液體系改變及操作溫度變化時(shí)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)氣泡，尤其在使用內(nèi)徑較小的柱時(shí)。氣泡一經(jīng)出現(xiàn)，必須及時(shí)清除，否則對(duì)層析工藝有明顯的影響。
2.2 緩沖液平衡介質(zhì)：
pH值是離子交換層析的操作中的一個(gè)重要因素，而pH的穩(wěn)定及改變通常是用緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所以緩沖液的選擇是影響分離效果的重要因素。
在選擇緩沖液時(shí)，pH和離子強(qiáng)度是兩個(gè)關(guān)鍵性的因素，它不僅影響到分離介質(zhì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離效果，而且還影響到產(chǎn)品的收率。選用的pH值取決于目標(biāo)產(chǎn)物的等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和溶解度，不但要使被分離的物質(zhì)成為可以進(jìn)行交換的離子，還要維持其較高的活性。同時(shí)也應(yīng)該考慮到離子交換劑的pK值。
由于緩沖液本身帶電，所以也會(huì)與離子交換層析介質(zhì)結(jié)合。這種結(jié)合將帶來(lái)兩方面的干擾，一方面降低緩沖液的濃度，進(jìn)而降低了緩沖能力；另一方面是與分離介質(zhì)進(jìn)行交換，從而與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)介質(zhì)的交換容量。因此，在使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，要避免采用磷酸鹽之類(lèi)的帶負(fù)電的緩沖液，在使用陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則要避免采用Tris之類(lèi)的帶正電的緩沖液。由于分離介質(zhì)的種類(lèi)不同，起始過(guò)程也略有不同，在通常情況下，使用陰離子交換層析介質(zhì)時(shí)，起始緩沖液要高于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值；使用陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)時(shí)，則起始緩沖液要低于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)0.5 ~ 1 pH值。
2.3 層析柱的操作：
2.3.1 操作方式：
由于生化分離的樣品、緩沖液和洗脫液都是流動(dòng)相，可在流經(jīng)柱時(shí)進(jìn)行分離，因此，離子交換可以采用柱式操作，以層析形式進(jìn)行分離。在分離過(guò)程中，未被吸附的物質(zhì)不斷流出反應(yīng)體系，使平衡不斷右移，是一種動(dòng)態(tài)平衡，所以也稱為動(dòng)態(tài)操作。動(dòng)態(tài)操作方式分離效果好，適用于各類(lèi)樣品，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。在層析分離的操作中，層析柱的裝填情況對(duì)分離有一定的影響，介質(zhì)在柱內(nèi)要分布均勻，尤其不允許氣泡的存在，也應(yīng)防止介質(zhì)產(chǎn)生分層現(xiàn)象。
對(duì)于一些粘度較大的樣品，進(jìn)行初步提取分離時(shí)，也可以采用“靜態(tài)”處理方法，經(jīng)離子交換劑與需處理的工作液在反應(yīng)容器中進(jìn)行攪拌，當(dāng)達(dá)到吸附平衡后，將介質(zhì)與殘液分離，裝入柱中進(jìn)行洗脫。這種靜態(tài)分批操作的方法，工藝設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，如肝素鈉等一些天然產(chǎn)物的初步分離，往往采用這種靜態(tài)分離方式。在靜態(tài)分離方式的操作中，應(yīng)適當(dāng)控制離子交換劑在工作液中的攪拌速度，若攪拌速度過(guò)快，剪切力過(guò)大，會(huì)造成離子交換顆粒的破碎，難以進(jìn)行過(guò)濾分離；但若攪拌速度過(guò)慢，則影響介質(zhì)與工作液的接觸，也影響交換速率。
2.3.2 柱式操作的種類(lèi)：
固定床分離：在柱式操作中，料液作為流動(dòng)相，在柱內(nèi)自上而下地流動(dòng)，在流動(dòng)的過(guò)程中進(jìn)行吸附。為了得到較好的分離效果，對(duì)分離柱有三點(diǎn)最基本的要求：分離柱底部要有孔徑分布均勻的篩板，以防止流動(dòng)相產(chǎn)生偏流；分離柱支持層下端的死角體積要盡量地小，以防止分離過(guò)程中色譜帶混合或擴(kuò)展；無(wú)論大小，分離柱都必須保持垂直。在固定床操作中，可以進(jìn)行正向洗脫，也可以進(jìn)行逆向洗脫，一般情況下，逆向洗脫或再生可獲得較好的效果，但對(duì)操作有較為嚴(yán)格的要求。
流態(tài)床：流動(dòng)的料液從柱的下端流入，從上端流出，分離介質(zhì)在柱內(nèi)呈流態(tài)狀。此種分離方法對(duì)操作有嚴(yán)格的要求，一般較少應(yīng)用，洗脫方式以采用正向洗脫為好。
2.3.3 工作液對(duì)分離效果的影響：
為了使生化分離達(dá)到高分辨率及高負(fù)載量，工作液的制備及性能也是非常重要的因素。工作液的粘度、澄清度等不但影響離子交換劑的分離效果，還影響到分離介質(zhì)的使用壽命。生化分離往往是一個(gè)比較復(fù)雜的體系，其中有多種雜質(zhì)存在，不但有簡(jiǎn)單的小分子，還有一些膠體物質(zhì)、脂類(lèi)物質(zhì)等，尤其是一些不可逆吸附的大分子往往包裹覆蓋了介質(zhì)的功能基團(tuán)，或堵塞了介質(zhì)的孔道，造成不可逆污染，縮短分離介質(zhì)的使用壽命。因此，在分離操作前，應(yīng)盡量將工作液進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以確保分離的效果。
在生化分離純化過(guò)程中，由于淋洗過(guò)程帶走了一些目標(biāo)產(chǎn)物，或因洗脫不完全而使目標(biāo)產(chǎn)物滯留在介質(zhì)上，造成產(chǎn)物的損失，是影響產(chǎn)品收率的重要因素，同時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化引起失活，也將影響活化收率。在離子交換過(guò)程中加入一些穩(wěn)定劑或保護(hù)劑，不但可以提高收率，還可提高分離介質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性。
2.3.4 流速對(duì)分離效果的影響：
離子交換層析分離中，流速是影響分離效果的一個(gè)重要因素。為了獲取優(yōu)良的分離效果，應(yīng)根據(jù)離子交換劑的種類(lèi)、粒徑、工作液中有效成分的分子結(jié)構(gòu)等因素，進(jìn)行試驗(yàn)，以確立較佳的試驗(yàn)參數(shù)。若目標(biāo)產(chǎn)物的分子量相對(duì)比較小，且介質(zhì)的孔徑比較大時(shí)，因?yàn)橛欣趥髻|(zhì)作用，可采用較高的流速。而對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物為生物大分子，且介質(zhì)的孔徑相對(duì)于被分離物質(zhì)分子較小時(shí)，由于分子的擴(kuò)散速率較慢，則宜采用較慢的流速。在工作液的粘度較大時(shí)，因傳質(zhì)速率較低，也應(yīng)采用較低的流速。
流速不但影響交換吸附的效果，也影響洗脫的效果，通常情況下，洗脫時(shí)的流速要比交換吸附時(shí)慢些。
2.4 介質(zhì)的洗脫、再生方式：
當(dāng)離子交換劑失效后，應(yīng)進(jìn)行洗脫，其基本原理是用一種比吸著物質(zhì)更活潑的離子或基團(tuán)，把交換吸附到介質(zhì)顆粒外表面和內(nèi)部的目標(biāo)產(chǎn)物解吸下來(lái)。吸著物不同，其活潑性不同，因此，應(yīng)選擇合適的洗脫劑，將蛋白質(zhì)從介質(zhì)上洗脫下來(lái)，收集分離純化的產(chǎn)物。
離子交換層析大致有三種洗脫方式：
一種為同步洗脫。洗脫劑是同一種物質(zhì)，可采用稀的酸、堿或鹽類(lèi)溶液，也可選用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，其中以鹽溶液為主，依據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)及最終得到產(chǎn)物的劑型進(jìn)行選擇。由于被吸著的物質(zhì)往往不是單一的品種，各種物質(zhì)所帶的電荷電量不同，與介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度不同，即使使用同一種洗脫劑，容易被替換的物質(zhì)先脫離介質(zhì)流出，結(jié)合力較強(qiáng)的物質(zhì)后流出，只要通過(guò)分級(jí)收集，就可以把各種物質(zhì)分離，得到較純凈的產(chǎn)物。這種方法多用于對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的性能了解很清楚時(shí)的分離，或用于分析類(lèi)的分離。
第二種為分步洗脫，即分別用不同濃度的鹽溶液進(jìn)行洗脫。分離介質(zhì)在交換吸附過(guò)程中，會(huì)有多種蛋白質(zhì)被吸附，如果采用一個(gè)恒定的洗脫條件，有時(shí)不能將所有的組分適當(dāng)?shù)胤珠_(kāi)，需要改變洗脫條件?？梢允请A段式的改變，即選用不同的洗脫劑或不同pH值的洗脫劑分階段進(jìn)行洗脫，可以根據(jù)洗脫液不同的濃度、不同的酸度得到不同的洗脫峰。即一種鹽濃度可以得到一種目標(biāo)蛋白，不同的鹽濃度可以得到不同的目標(biāo)蛋白。這種分步洗脫的方式，適用于已知性質(zhì)蛋白的分離，尤其適用于規(guī)模生產(chǎn)中，操作方便，易于控制。
第三種為連續(xù)的梯度洗脫，即按一定的線性變化改變洗脫液的離子強(qiáng)度或pH值（一般只在特殊情況下使用改變pH值的洗脫方式），在洗脫劑漸變的過(guò)程中，將不同的蛋白質(zhì)逐一置換，可得到各種不同的蛋白組分，同時(shí)，蛋白質(zhì)一般不拖尾。梯度洗脫是離子交換層析中最常用的洗脫方式，也是洗脫能力相對(duì)最強(qiáng)的洗脫方式，適合于對(duì)電荷性質(zhì)相近組分的洗脫。
在洗脫過(guò)程中，順流洗脫或逆流洗脫均可采用，順流洗脫也稱為正向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相同，逆流洗脫也稱為反向洗脫，即洗脫液的流動(dòng)方向與工作液的流動(dòng)方向相反。若料液是自上而下正向通過(guò)交換柱進(jìn)行交換吸附的，則交換柱上層吸附物的濃度要比下層高，洗脫液自下而上反向解吸可以更高效地達(dá)到洗脫的目的。但由于逆向洗脫的操作要比正向洗脫復(fù)雜得多，故目前多以正向洗脫為主。
洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離的效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來(lái)說(shuō)，慢速洗脫的分辨率要比快速洗脫好，但洗脫速度過(guò)慢，會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)，樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中于某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來(lái)提高分辨率。如果分辨率較好，但洗脫峰過(guò)寬，則應(yīng)適當(dāng)提高洗脫速度。
2.5 介質(zhì)的消毒：
在某些純度要求較高的生化產(chǎn)品制備過(guò)程中，往往要求對(duì)分離介質(zhì)進(jìn)行消毒處理，以防止微生物等雜質(zhì)混入目標(biāo)產(chǎn)品中。
采用高溫消毒是最常用的方法，目前大多數(shù)離子交換劑具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性能，均可進(jìn)行高溫消毒處理。但在使用多糖類(lèi)介質(zhì)時(shí)，必須注意，介質(zhì)一定要處于鹽型，而且要在中性條件下才能進(jìn)行高溫消毒處理，否則將會(huì)導(dǎo)致多糖大分子骨架的降解，嚴(yán)重影響介質(zhì)的使用壽命。
NaOH也是一種很好的消毒劑，但要根據(jù)介質(zhì)的耐堿程度和微生物污染的種類(lèi)、污染程度選用合適濃度的NaOH。這種消毒方法也可以采用柱內(nèi)浸泡法，即將一定濃度的NaOH通入柱中，關(guān)閉出液閥，浸泡幾個(gè)小時(shí)后，可達(dá)到消毒的目的。NaOH如果與乙醇合用，可以得到更佳的效果。用NaOH消毒還可將消毒和在位清洗合并處理。
2.6 介質(zhì)的“復(fù)蘇”：
在生化分離過(guò)程中，由于分離體系較為復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)，因此在使用過(guò)程中常出現(xiàn)樹(shù)脂的“中毒”現(xiàn)象。中毒原因可能是由于大分子的多點(diǎn)帶電，與介質(zhì)進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合，致使難以洗脫，使介質(zhì)的有效功能基團(tuán)減少。也可能是一些較大的分子被“卡牢”在孔道內(nèi)，難以擴(kuò)散出來(lái)，堵塞了孔道，在以后的交換過(guò)程中影響到顆粒內(nèi)功能基團(tuán)的有效工作。除生物大分子外，色素及腐殖酸等都可使介質(zhì)中毒。有時(shí)工作液中的膠狀物質(zhì)被粘附于介質(zhì)顆粒的內(nèi)外表面，覆蓋了功能基團(tuán)，這也是影響介質(zhì)工作容量的重要因素。
由于上述原因，離子交換層析介質(zhì)在使用一段時(shí)間后，可能出現(xiàn)顏色變深、床體收縮、分辨率下降、蛋白質(zhì)收率降低、反壓升高等現(xiàn)象。此時(shí)，需要對(duì)介質(zhì)進(jìn)行凈化處理。對(duì)于介質(zhì)用量比較大，自動(dòng)化程度比較高的規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)采用在原交換柱內(nèi)進(jìn)行，即“在位清洗”。先從交換柱的下面通過(guò)適量的清水，目的是去除交換柱中的懸浮物，并將床體疏松，還可以將結(jié)塊的介質(zhì)分散，有利于以后介質(zhì)與清洗液的接觸。對(duì)于一般的污染，采用逆流清洗，可減少污染物對(duì)下層介質(zhì)的污染。應(yīng)根據(jù)介質(zhì)種類(lèi)及污染程度的不同，分別選用不同種類(lèi)的清洗劑及不同的清洗步驟。一般的介質(zhì)是用2mol/L的NaCl、1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCl或1mol/L的HCl溶液交替分階段清洗或浸泡，各試劑交替之間須用去離子水洗至中性。若經(jīng)過(guò)上述處理后仍無(wú)明顯改善，尤其是流速無(wú)明顯提高，則要檢查交換柱布水器的紗網(wǎng)是否出現(xiàn)堵塞。
上述過(guò)程即為通常所說(shuō)的“復(fù)蘇”過(guò)程。不同的介質(zhì)應(yīng)選用不同的復(fù)蘇方法，主要取決于介質(zhì)的物理化學(xué)性能及污染物質(zhì)的性質(zhì)。對(duì)于多糖類(lèi)的離子交換劑，每當(dāng)使用一段時(shí)間后，可采用離子濃度較大的緩沖液通過(guò)交換柱或浸泡介質(zhì)，因?yàn)榫彌_液的離子強(qiáng)度較大時(shí)，有利于蛋白質(zhì)大分子脫離介質(zhì)，達(dá)到復(fù)蘇的效果。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的介質(zhì)，也可使用NaCl溶液通過(guò)交換柱或浸泡介質(zhì)。對(duì)于物化結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的介質(zhì)，可用30℃~40℃的乙醇或丙酮進(jìn)行洗脫或浸泡，在高溫下可使吸附在介質(zhì)上的蛋白變性或加快擴(kuò)散速度，也有利于膠體物質(zhì)的破壞，從而使污染物脫離介質(zhì)。還可在乙醇或NaOH溶液中加入NaCl，更有利于介質(zhì)的復(fù)蘇。
清除沉淀蛋白、脂類(lèi)、疏水性的蛋白及脂蛋白，處理步驟更為復(fù)雜?？刹捎?00%的異丙醇、20%的乙腈、2mol/L的NaOH溶液、75%的乙酸、20%的乙醇、100%的甲醇或6mol/L的鹽酸胍、陽(yáng)離子或非離子洗滌劑等作為處理液。在用過(guò)這些清洗劑后，都要用至少2倍體積的蒸餾水進(jìn)行清洗。使用有機(jī)溶劑后，交換柱要采用鋸齒形的梯度洗滌進(jìn)行清洗，即可以在5倍床體積內(nèi)，使溶劑的含量從0增至100%，然后在下一個(gè)5倍床體積中，使溶劑的含量從100%降到0。
如果經(jīng)過(guò)上述處理，交換柱的工作情況仍沒(méi)有恢復(fù)，可以使用蛋白水解酶，將仍滯留在介質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，使其脫離介質(zhì)。可以采用含有1mg/mL胃蛋白酶的0.1mol/L 乙酸溶液及0.5 mol/L 的NaCl溶液注入到交換柱中，在室溫下浸泡過(guò)夜，或在37℃下浸泡一小時(shí)。根據(jù)污染物的情況，也可以采用DNA酶等其它的酶類(lèi)。無(wú)論使用哪一種酶處理后，都要重復(fù)上述清除污染物的清洗步驟，把酶清洗干凈。
脂蛋白對(duì)分離介質(zhì)的污染比較嚴(yán)重，因?yàn)橹鞍准捌渌?lèi)物質(zhì)，很容易粘附在層析柱內(nèi)，最好在進(jìn)行分離工藝前先將其去除。推薦使用硫酸葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮等沉淀劑，可去除高含量的脂蛋白。
2.7 介質(zhì)的貯存：
各種分離介質(zhì)在使用后都要進(jìn)行清洗后再貯存，這對(duì)于多糖類(lèi)分離介質(zhì)尤為重要。分離介質(zhì)在使用后，先用2個(gè)床體積的清水清洗，然后用2個(gè)床體積的20%的乙醇過(guò)柱。對(duì)于SP強(qiáng)酸性陽(yáng)離子介質(zhì)，要用含有0.2mol/L乙酸鈉的20%乙醇溶液清洗，再用脫氣的乙醇-水溶液以較慢的流速清洗。經(jīng)過(guò)處理后，可在室溫下貯存，或在4~8℃下長(zhǎng)期存放。貯存過(guò)程中必須將層析柱全部封閉，以防止水分的揮發(fā)，造成干柱。暫時(shí)不用的介質(zhì)必須貯存在20%的乙醇溶液中。所有的離子交換分離介質(zhì)，都要在4℃~30℃的條件下貯存，并防止冷凍。
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