1. 凝膠層析的分離方式
凝膠層析按其分離方式，主要可分為組族分離和分級(jí)分離兩大類型。
1.1 組族分離：
組族分離是將樣品中的各組分分成大小不同的兩類分子，然后從低分子量物質(zhì)中分離出高分子量的物質(zhì)，或者從高分子量物質(zhì)中除去低分子量物質(zhì)的一種分離方法。在這種情況下，高分子量的物質(zhì)完全被凝膠層析介質(zhì)所排阻，不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部，而隨洗脫液流出層析床；小分子量物質(zhì)則可以擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，洗脫體積幾乎相當(dāng)于床體積。這種被分離物質(zhì)之間在分配系數(shù)上有極為明顯的差別，稱為組分離、組別分離或組族分離。
組族分離常用于生物產(chǎn)品的制備工藝中，如脫鹽，即小分子鹽與生物大分子的分離，或在生物制品的最后階段脫除低分子物質(zhì)的精制工序等。組族分離，只能將樣品達(dá)到粗分離的目的，只有分子量相差懸殊的物質(zhì)才能得以分離，分子量相差越大，分離效果越好。這種分離方法的應(yīng)用范圍比較廣泛，如在電泳和離子交換層析前工作液的脫鹽、樣品中緩沖液的替換、蛋白質(zhì)的脫鹽、核酸制備中酚及無(wú)機(jī)鹽等小分子的去除等。由于這種操作具有方便易行、設(shè)備簡(jiǎn)單、蛋白質(zhì)回收率高且樣品稀釋度低等優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期在制備分離中廣泛應(yīng)用。目前凝膠層析蛋白質(zhì)脫鹽工藝，幾乎完全替代了透析法。脫鹽工藝中凝膠層析介質(zhì)的體積通常為樣品體積的4~5倍，流速可達(dá)200cm/h左右。
1.2 分級(jí)分離：
分級(jí)分離是將分子大小相近的物質(zhì)分開(kāi)，其分辨率要比組族分離高，但有時(shí)洗脫曲線之間會(huì)產(chǎn)生洗脫峰的重疊。分級(jí)分離常用于物質(zhì)的分析，如分子量的測(cè)定，生物制品在精制時(shí)也采用分級(jí)分離，即為獲取高活性部分的生物制品，得到純品的精制過(guò)程。這種方法要使物質(zhì)完全分離是比較困難的，受到多種因素的影響。選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x介質(zhì)尤為重要，必須采用孔徑適當(dāng)、分離范圍與分子大小相適應(yīng)的凝膠介質(zhì)。在操作方面，樣品的上樣量較少，僅為床體積的5%~10%，因此這種分離常用于經(jīng)過(guò)濃縮后的樣品。把分離柱加長(zhǎng)，可提高分離效果，但會(huì)增加床的壓力降，減低流速。
組族分離和分級(jí)分離二者不但在應(yīng)用方面有區(qū)別，在操作方面也有所不同。組族分離的上樣量較大，分離容量大，但分辨率低；而分級(jí)分離的上樣量少，分離容量小，但分辨率高。但是，這二者之間并沒(méi)有截然的區(qū)別。除脫鹽及分級(jí)分離外，凝膠層析還適用于變性蛋白質(zhì)的復(fù)性及中草藥有效成分提取分離等工藝，也可進(jìn)行多肽、蛋白質(zhì)、核酸及其它大分子物質(zhì)分子量的測(cè)定及緩沖液的置換。
2. 凝膠層析介質(zhì)的選擇
2.1 類型的選擇：
在進(jìn)行組族分離時(shí)，因?yàn)楸环蛛x物質(zhì)的分子量差距較大，因此易于選擇凝膠。通常選用孔徑小、排阻極限小的凝膠。由于凝膠層析介質(zhì)的孔隙小，鹽等小分子可以擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而大分子不能擴(kuò)散進(jìn)入，沿液體的流動(dòng)方向從柱中流出，達(dá)到分離的目的。
對(duì)于分級(jí)分離，凝膠的選擇非常重要，因?yàn)楸环蛛x物質(zhì)的分子量接近，要根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量及各種凝膠的選擇性特性曲線進(jìn)行選擇。一般先選擇排阻極限較低的凝膠，這類介質(zhì)由于孔徑小，珠體的剛性較強(qiáng)，流速可以有較大的選擇范圍，有利于操作，使被分離物質(zhì)的洗脫較快，且活性物質(zhì)的活性回收率較高。若是在水溶液中操作，則選擇親水性的介質(zhì)；若是在疏水性的有機(jī)溶劑中進(jìn)行分離，則必須選用疏水性的介質(zhì)。
2.2 型號(hào)的選擇：
在組族分離時(shí)，凝集介質(zhì)的選擇比較容易，因?yàn)橐蛛x的兩類組分在分子量上又很大的差異，因而容易進(jìn)行完全地分辨。應(yīng)選擇分子量在排阻極限以上的凝膠介質(zhì)，是大分子量的物質(zhì)不擴(kuò)散進(jìn)入凝膠內(nèi)部，在外水體積時(shí)洗脫，這樣區(qū)帶的擴(kuò)散和稀釋程度最小，并能減少目標(biāo)產(chǎn)物留在柱上的時(shí)間。脫鹽工藝中常選用中等粒徑的葡聚糖凝膠。相對(duì)分子質(zhì)量低至5000的目標(biāo)產(chǎn)物組分需要脫鹽時(shí)，都可以選用它。這類凝膠介質(zhì)具有較好的剛性、優(yōu)良的通透性及較好的流速。
對(duì)于分級(jí)分離而言，選擇凝膠介質(zhì)是一項(xiàng)重要的工作，因?yàn)樾枰蛛x的物質(zhì)是一系列分子量接近的成分。選擇時(shí)需要考慮被分離物質(zhì)的分子量與凝膠介質(zhì)的選擇性曲線，即必須考慮凝膠介質(zhì)的分離范圍，如果凝膠介質(zhì)選擇不當(dāng)，會(huì)使幾種被分離的物質(zhì)幾乎同時(shí)從柱中流出，或可以同時(shí)在凝膠介質(zhì)的孔中擴(kuò)散，而得到的分離譜圖的洗脫峰都在外水峰中，或洗脫峰重疊，達(dá)不到分離的目的。
如果在分離中需要使用解離劑或洗滌劑時(shí)，凝膠介質(zhì)的選擇更應(yīng)注意，要考慮到它們對(duì)被分離分子的構(gòu)型所產(chǎn)生的影響。因?yàn)橛靡恍┫礈靹┳鳛橹軇?duì)一些水溶性較低的膜蛋白組分尤為合適，但對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)型有一定的影響，因此要選用孔徑更大一些的凝膠介質(zhì)較為合適。
由于各種凝膠介質(zhì)的分類范圍有時(shí)會(huì)部分重疊，對(duì)一些目標(biāo)產(chǎn)物可選用的分離介質(zhì)也可能不止一種。這時(shí)通?？蛇x擇排阻極限較低的凝膠介質(zhì)，以使目標(biāo)產(chǎn)物洗脫較快，還有可能提高目標(biāo)產(chǎn)物的活性回收。此外，對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)相同的凝膠介質(zhì)，低排阻極限者往往有更佳的剛性，應(yīng)用時(shí)可在較大的范圍內(nèi)選擇流速，有利于生產(chǎn)效率的提高。
2.3 粒徑的選擇：
介質(zhì)的粒徑要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況而選擇，尤其要根據(jù)分類對(duì)象及要求達(dá)到的目的而選擇。粒徑較小的分離介質(zhì)，顆粒在柱內(nèi)易于分布均勻，形成的層析帶擴(kuò)散較小，分辨率高，但流速較慢，主要用于分辨率要求較高的分級(jí)分離，適用于分析層析、小柱操作、少量樣品的精制及分子量的測(cè)定等。粒徑較大的分離介質(zhì)，柱的通透性好，流速較快，適宜于處理大量的工作液，如脫鹽或分子量較大的物質(zhì)之間的分離，因而在規(guī)模生產(chǎn)中，多選用粒徑較大的介質(zhì)。但無(wú)論選擇哪種類型的分類，都要求介質(zhì)具有較窄的粒徑分布，因?yàn)榱椒植荚骄鶆?，柱的分辨率就越高，越易得到理想的分離效果。
3. 凝膠層析柱的選擇
3.1 柱結(jié)構(gòu)的選擇：
為了獲得最佳的凝膠層析效果，應(yīng)注意柱體設(shè)備的選用。層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主要部件，一般用玻璃管或有機(jī)玻璃管。在柱的下部應(yīng)有孔徑分布均勻的篩板，以利于流動(dòng)相均勻地流出，防止柱內(nèi)液體的偏流。在層析柱的濾板下，死體積應(yīng)盡量地小，如果支撐濾板下的死體積大，則被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果將影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，降低分辨率。在精確分離時(shí)，死體積不能超過(guò)床體積的千分之一。
在選用層析柱的材質(zhì)及柱體時(shí)，還必須考慮柱的耐壓及耐溶劑性。柱體及各連接部件都必須選用耐酸堿及耐有機(jī)溶劑的材質(zhì)，以利于延長(zhǎng)層析柱的使用壽命，并可避免對(duì)分離物的污染。
3.2 柱內(nèi)徑的選擇：
雖然層析柱直徑的大小不影響分離度，但也要選用內(nèi)徑合適的柱體。較細(xì)的柱體有時(shí)會(huì)產(chǎn)生管壁效應(yīng)，而直徑過(guò)大，則稀釋將成為一項(xiàng)不利的因素。柱體的直徑應(yīng)根據(jù)分離物的量來(lái)選用，在加樣時(shí)應(yīng)將樣品均勻地分布于凝膠層析柱的床面上。制備用的凝膠層析柱，直徑一般大于2cm，樣品量較大時(shí)，可加大柱的直徑。柱的直徑加大后，洗脫液的體積將增大，樣品的稀釋度也將加大。
3.3 柱長(zhǎng)度的選擇：
凝膠層析中兩個(gè)被分離區(qū)帶的分離度取決于柱的高度，為分離不同的組分，層析柱必須有合適的高度，分辨率與柱體長(zhǎng)度的平方根而成正比。因此適宜選用較長(zhǎng)的柱體，尤其是分級(jí)分離，以便于獲得最佳的分辨率。但對(duì)于某些基質(zhì)較軟的凝膠介質(zhì)，若床柱過(guò)高，珠體受擠壓會(huì)發(fā)生變形，影響流速，所以一般應(yīng)不超過(guò)1米。通常在進(jìn)行組族分離時(shí)，層析柱的長(zhǎng)度大多在2~30cm之間，在進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，層析柱的長(zhǎng)度需要100cm左右。層析柱的直徑一般在1~5cm之間，小于1cm易產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。層析柱的長(zhǎng)度與直徑的比值一般宜在7~10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)，宜在30~40之間。對(duì)于分離精度要求較高的工藝，也可采用層析柱串聯(lián)的方法，可以提高層析柱的分辨率。
選擇層析柱的一般原則是，柱的長(zhǎng)度取決于工藝所要求的分辨率，而柱的內(nèi)徑則取決于被分離樣品的量。在進(jìn)行脫鹽時(shí)，將所需體積的凝膠介質(zhì)充裝在短而粗的柱體內(nèi)，是最佳的脫鹽系統(tǒng)，這樣可以取得較大的體積流速，提高脫鹽的速度，減少對(duì)樣品的稀釋。而不宜選用長(zhǎng)而細(xì)的柱體。
4. 凝膠層析操作中應(yīng)注意的事項(xiàng)
4.1 凝膠層析介質(zhì)的溶脹、裝柱：
商品凝膠層析介質(zhì)有的為干燥顆粒，使用前先進(jìn)行水合膨脹，也可直接在洗脫液中進(jìn)行溶脹。溶脹必須徹底，否則影響層析的均一性，甚至?xí)袑游鲋浟训奈ｋU(xiǎn)。將凝膠介質(zhì)顆粒直接放入水或洗脫液中，攪拌均勻，在室溫下經(jīng)過(guò)10小時(shí)左右即可得到較充分的溶脹。為了加速溶脹，也可進(jìn)行加熱，即在沸水浴中將濕的凝膠漿逐漸升溫接近沸騰，這樣可大大加速溶脹的速度，約1~2小時(shí)即可達(dá)到平衡。加熱溶脹不但可以節(jié)省時(shí)間，還可消毒，除去凝膠介質(zhì)中的污染物和排除凝膠內(nèi)的氣泡。
凝膠層析介質(zhì)充分溶脹后即可進(jìn)行裝柱。層析柱安裝時(shí)要保證垂直，一般用泵將凝膠漿打入柱中。目前無(wú)論實(shí)驗(yàn)室或規(guī)模生產(chǎn)，都可以采用裝柱機(jī)進(jìn)行裝柱，這樣可使柱內(nèi)的介質(zhì)分布均勻，而且裝柱的速度也很快。如果是人工裝柱，應(yīng)將攪拌均勻的凝膠介質(zhì)一次性倒入柱中，不能產(chǎn)生分層現(xiàn)象。裝柱后必須檢驗(yàn)柱中介質(zhì)是否分布均勻，有無(wú)“紋路”或氣泡，這樣才能保證層析正常工作。在凝膠層析操作中，裝柱是影響分離效果的一個(gè)重要步驟，為確保裝柱效果，在裝柱后可用1%的丙酮進(jìn)行柱效測(cè)定，測(cè)定其理論塔板數(shù)。
4.2 柱的重復(fù)使用及保存：
凝膠層析介質(zhì)不會(huì)與被分離物質(zhì)發(fā)生任何作用，因而在層析分離后，只要稍加平衡就能進(jìn)行下一周期的工作，這是凝膠層析介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)之一。因此凝膠層析介質(zhì)在裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，而不影響分離效果。瓊脂糖系列的介質(zhì)，一般是以濕態(tài)出售，并保存在乙醇溶液中，因此在使用前應(yīng)先用大量的純水洗去乙醇后再進(jìn)行分離工序。
在實(shí)際操作中，常有一些雜質(zhì)污染凝膠介質(zhì)或?qū)游龃驳谋砻?，因此必須進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚恚宄@些“污染物”。應(yīng)根據(jù)污染的情況來(lái)決定處理的時(shí)間。一般情況下，輕微污染可以忽略，繼續(xù)使用。當(dāng)層析介質(zhì)顏色發(fā)生明顯變化，甚至層析柱表面出現(xiàn)沉淀物，使表面有明顯板結(jié)時(shí)，則必須進(jìn)行處理。除對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理外，對(duì)層析柱也要進(jìn)行凈化處理。如果沉淀物與溫度有關(guān)，可以用溫水或適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行洗滌，使沉淀溶解、去除。如果難以溶解，就必須將嚴(yán)重污染的表層介質(zhì)挖掉，并添加新的層析介質(zhì)。被污染的層析柱，可用0.2mol/L的NaOH和0.5mol/L的NaCl混合溶液進(jìn)行處理。這種方法，通?？上吹粢恍┪廴疚?。
如果污染嚴(yán)重，或?qū)游鲋?jīng)過(guò)若干次使用后，出現(xiàn)介質(zhì)的色澤改變，流速降低，表面有污染物等情況時(shí)，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行處理，恢復(fù)其原來(lái)的性質(zhì)和功能，這就是所謂的再生。對(duì)于多糖類的介質(zhì)，可采用溫?zé)岬?.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合溶液緩慢通過(guò)層析柱，甚至可以浸泡一段時(shí)間，以清除污染物，恢復(fù)層析柱的功能。
經(jīng)常使用的層析柱以濕態(tài)保存為好，只要在其中加入合適的防腐劑就可以防止幾個(gè)月甚至一年，并不需要將介質(zhì)干燥。特別是瓊脂糖介質(zhì)，不但干燥操作繁雜，而且干燥后不易溶脹，因此一般都以濕態(tài)保存。為了防止凝膠層析介質(zhì)中滋長(zhǎng)細(xì)菌，可將其保存在20%的乙醇溶液中，或堿性溶液中。尤其是乙醇溶液浸泡，已成為目前通用的保存方法。
4.3 對(duì)分離樣品的要求：
待分離的樣品必須無(wú)沉淀，且粘度不可太大，否則將影響分離的效果。因此在進(jìn)行層析之前，樣品應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，除去其中的不溶性雜質(zhì)，若能經(jīng)過(guò)超濾等方式除去其中的膠體物質(zhì)，不但可提高分離效果，還利于延長(zhǎng)層析柱的使用壽命。
根據(jù)分離模式的不同，上樣量略有差別，分析性分離及分級(jí)分離都需要最大的分辨率，與柱長(zhǎng)相比，要求起始區(qū)帶的寬度應(yīng)非常狹窄。此時(shí)樣品體積最好是柱體積的1%~5%。即使再減小樣品的上樣量，一般也不能再提高分辨率。對(duì)于組族分離及某些分級(jí)分離的實(shí)驗(yàn)中，峰的分離良好，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以增加樣品量，一般樣品液量可達(dá)凝膠層析床體積的10%。在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，有時(shí)樣品量也可高達(dá)凝膠層析床體積的20%~30%。上樣量適宜，洗脫出的峰形才能較好，才能提高分辨率。在規(guī)模生產(chǎn)中，為了提高生產(chǎn)效率，在能保障產(chǎn)品純度的情況下，可盡量加大樣品的用量。
樣品的粘度也是影響上樣量和層析柱分離效果的因素之一。粘度往往限制了所能采用的最高濃度用量。樣品濃度過(guò)高，使區(qū)帶不穩(wěn)定，流速也不規(guī)則，這樣會(huì)使峰帶嚴(yán)重?cái)U(kuò)寬和扭曲，影響分離效果和上樣量。此時(shí)應(yīng)使用適當(dāng)?shù)木彌_液降低樣品的粘度。
凝膠層析常作為下游的最終精細(xì)純化步驟，通常與其它的工藝或其它的柱層析聯(lián)合使用，例如肽、多糖、酶、重組蛋白、抗體及大蛋白等，樣品已經(jīng)過(guò)初步純化、濃縮，選用適當(dāng)?shù)纳蠘恿?，可以得到滿意的分離效果。
4.4 洗脫劑的選用：
在凝膠層析中，洗脫劑往往不直接影響分辨率。對(duì)于完全不帶電荷的物質(zhì)，可用蒸餾水進(jìn)行洗脫，帶電荷物質(zhì)的凝膠層析，可用適合的緩沖液進(jìn)行洗脫，以控制pH值。對(duì)于多糖類的分離介質(zhì)，緩沖液的離子強(qiáng)度至少應(yīng)為0.02mol/L。對(duì)于聚丙烯酰胺類的凝膠介質(zhì)，離子強(qiáng)度為0.05mol/L。使用一定離子濃度的緩沖液，其目的是防止被分離物質(zhì)與凝膠介質(zhì)骨架間的離子相互作用。有時(shí)在凝膠介質(zhì)的分級(jí)分離中，為避免生物大分子與凝膠介質(zhì)產(chǎn)生非特異性吸附，甚至可在緩沖液中加入0.1~0.2mol/L的NaCl。
5. 流速的選擇：
一般情況下，增加流速往往會(huì)使分辨率下降，在使用長(zhǎng)柱和低流速時(shí)，可以取得最大的分辨率，使用短柱和高流速時(shí)可以得到快速的分離。由此可見(jiàn)，良好的分辨率和分離時(shí)間是相互矛盾的。由于分離的物質(zhì)不同，柱的結(jié)構(gòu)不同，必須根據(jù)所要求的分辨率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳的流速以得到滿意的分離效果。
綜上所述，凝膠層析工藝參數(shù)對(duì)分離純化的效果有明顯的影響，不但凝膠層析介質(zhì)種類的選擇有重要影響，其它各工藝參數(shù)，如柱的高徑比、流速、介質(zhì)的床高等因素都影響分離效果。而參數(shù)的確立，要根據(jù)待分離的物質(zhì)及所要求的純度，通過(guò)實(shí)驗(yàn)而確定。
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